GIDALARDA DİET LİF ANALİZİ

1) Yöntemin İlkesi

Analinizi yapılacak olan örnek sabit sıcaklıkta sırasıyla a-amilaz, proteaz ve

2) Kullanılan Kimyasallar

a-amilaz (Sıcaklığa dayanıklı)

Proteaz: MES/TRIS tamponu ile 50 mg/ml’lik çözeltisi hazırlanır. Bu çözelti deney yapılacağı zaman taze hazırlanmalıdır.

Amiloglukosidaz

MES/TRİS tamponu: 19.52 g 2(N-morfolin)etan sülfonik asit (MES) ve 14.2 g tris(hidroksimetil)aminometan (TRİS) 1.7 L deiyonize suda çözülür. Çözeltinin pH’ sı 6 N NaOH ile 8.2’ ye ayarlanır.

0.561 N HCl asit çözeltisi: 700 mL saf su üzerine 93.5 ml 6 N HCl asit koyularak 1Lt ye tamamlanır.

%98 ‘lik etil alkol (Merck 1.00983)

%78 ‘lik etil alkol (Merck 1.00983 )

Aseton (Merck 1.00013 )



3) Deneyin Yapılışı

Yaklaşık 1 g ( M) yağsız – örnekteki yağ uzaklaştırılmalıdır- deney numunesinin (deney iki paralelli götürülmelidir) üzerine 40 ml MES/TRIS tamponu eklenir. 200 mL sıcaklığa dayanıklı a-amilaz eklenerek 100 °C ‘de 35 dakika bekletilir. Daha sonra 100 mL proteaz enzimi eklenerek 60 °C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletilir. 0.561 N HCl ile çözeltisinden 5 ml eklenerek çözeltinin pH’sı 4.1- 4.8 aralığına getirilir. 300 mL amilo glukosidaz eklenerek tekrar 60°C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletilir. Çözelti vakum altında sabit tartıma ( m1) getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür. Çökelek 70°C sıcaklıkta 10 ml su ile iki kere yıkanır.

Kalıntıda çözünmeyen, süzüntüde çözünen diyet lif analizi yapılır.



3.a) Çözünmeyen Diyet Lif



Kalıntı, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.

Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m2). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül ( k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

3.b)Çözünen Diyet Lif

Süzüntünün ağırlığı 80 g olana kadar üzerine saf su eklenir. Önceden 60°C’ye ısıtılmış % 95 ‘lik 320 ml etanol eklenir. Çökme işleminin tamamlanması için 1 saat bekletilir. Çözelti sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür. Kalıntı, 20 ml %78 ‘lik etanolle 3 kere, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.



Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m3). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.



Eğer toplam diyet lif aranıyorsa 300 mL amilo glukosidaz eklenerek 60°C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletildikten sonra %95 lik etil alkolden 225 ml eklenerek 60°C ‘lik su banyosunda altmış dakika bekletilir. Çözelti süzülür. Kalıntı, 20 ml %78 ‘lik etanolle 3 kere, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.

Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m4). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.



4) Hesaplamalar

Ağırlıkları bulunan kalıntılardan doğru sonuca varabilmek için, bulunan kül ve protein toplam miktarları çıkarılır.



% Toplam diyet lif = [(m4 - m1) –( k+ p ) x100] / M

% Çözünmeyen Diyet Lif = [(m2 - m1) –( k+ p ) x100] / M

% Çözünen Diyet Lif = [(m3 - m1) –( k+ p ) x100] / M



m1 = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinin ağırlığı (g)



m2 = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + çözünmeyen diyet lifteki kalıntının ortalama ağırlığı (g)

(m2 + m2’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için



m3 = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + çözünen diyet lifteki kalıntının ortalama ağırlığı

(m3 + m3’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için



m4 = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + toplam diyet lifteki kalıntının ortalama ağırlığı

(m4 + m4’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için



M = (M1 + M2) /2 örnek 2 paralelli götürüldügü için ortalama örnek ağırlığı (g)